Презентация Фотометрические методы биохимического анализа онлайн

Содержание слайда: Фотометрические методы биохимического анализа

Содержание слайда:

Содержание слайда: Методы сравнения стандартного и опытного образца Анализируемая и стандартная проба обрабатываются в одинаковых условиях При больших сериях – стандартную пробу исследовать в начале серии и через каждые 20 проб Расчет ведут по ствндарту или по фактору Расчет по стандарту: Сi = Di х Cст/Dст Расчет по фактору: С = D х F

Содержание слайда: Методы определения без использования калибратора Фотометрические единицы (в случае отсутствия калибратора – средние молекулы, серомукоид) – оптическую плотность умножают на 100 (D = 0,3, ответ – 30 единиц)

Содержание слайда: Методы определения без использования калибратора Определение концентрации по молярному показателю поглощения – применение закона Бургера С = D/lхξ (концентрация определяется делением измеренной оптической плотности на известный для данного вещества молярный показатель поглощения при длине волны измерения: С = D/ξ) Учитывать разведение образца

Содержание слайда: Спектральные характеристики хромогенов

Содержание слайда: Примеры: Определение концентрации НАДН на основе определения оптической плотности Молярный показатель НАДН при 340 нм 6,22х10 3 лхмоль -1см-1. (ввести верхний символ). Измерена оптическая плотность в 1 см кювете – 0,38 Концентрация НАДН определяется по соотношению

Содержание слайда: Измерение скорости изменения поглощения Фотометрические измерения проводят непосредственно при протекании реакции Потребление субстратов Повышение концентрации продуктов Изменение кофакторов (оптический тест Варбурга)

Содержание слайда:

Содержание слайда: Сопряженные реакции

Содержание слайда: При кинетическом определении вычисляют изменение поглощения за 1 минуту F

Содержание слайда: Единицы активности ферментов Катал – количество фермента, превращающего 1 моль субстата за 1 сек МЕ - количество фермента, превращающего 1 мкмоль субстата за 1минуту МЕ/л↔0,0167 мккат/л или МЕ/л↔16,7 нкат/л

Содержание слайда: Измерение по конечной точке Реакция развивается за некоторый период времени и достигает определенного конечного состояния (конечная точка) При измерении по конечной точке уровень сигнала соответствует количеству продуктов реакции в инкубационной среде после фиксированного времени инкубации Поглощение измеряется после окончания реакции при стабильном значении сигнала

Содержание слайда: 1-точечное измерение на двухлучевом фотометре Измерение ведется в режиме сравнения растворов в двух кюветах В каждую кювету вносится одинаковое количество реактива, в 1-ую – проба с известной концентрацией (стандартная), в другую – такое же кол-во воды (физ. р-ра) – бланк. Бланк автоматически вычитается

Содержание слайда: Измерение с бланком на однолучевом фотометре Для исключения систематического влияния (рабочий реактив, отражение от стенок кювет, темновой ток) используют измерение относительно холостой пробы (бланка) Бланк определяют по рабочему реактиву перед измерением пробы Dпробы = Dконечной точки – Dбланка Процедура сходна с одноточечным измерением, но учет бланка проводится в ручном режиме

Содержание слайда: Рабочая таблица для определения концентрации методом измерения с бланком по рабочему реактиву

Содержание слайда: Измерение с прозоной Разновидность измерения с бланком Измерение в одной кювете, отсутствует кювета сравнения Проводят определение до прибавления биопробы Характерен для биохимических анализаторов (двухточечное измерение с прозоной) Прозона – временной период до добавления в кювету пробы. При добавлении нескольких реактивов прозона определяется при достижении стабильного состояния после внесения всех реактивов перед пробой

Содержание слайда: Двухволновое измерение с опорной длиной волны Необходимо для исключения мешающих факторов (гемолиз, иктеричность, липемичность, использование исчерченных кювет) Измерение проводят на 2 длинах волн – основной и поддерживающей Измеряется только сигнал, связанный с аналитом Может применяться на приборах, у которых кювета облучается белым светом, а монохроматор расположен после кюветы Опорная волна не должна отступать от основной более, чем на 100 нм

Содержание слайда: Принцип получения информации о степени иктеричности, липемичности и гемолиза сывортки 20 мкл сыворотки, смешать с 200 мкл дистиллированной воды, добавить 600 мкл 0,15 М фосфатный буфер (рН = 7,4) Раствор измеряется при длинах волн 460, 500, 576, 597, и 750 нм Вычисляются ∆D 460/500 (разность плотностей) (иктеричность) ∆D 576/597 (разность плотностей) (гемолитичность) ∆D 597/750 (разность плотностей) (липемичность)

Содержание слайда:

Содержание слайда: Кинетические измерения Определение меняющейся в ходе реакции оптической плотности Широко используется для определения активности ферментов Требует точного поддержания температуры в измерительной кювете (+ 0,1º С), правильного отсчета временных интервалов Условия обязательны, доступны только при использовании современных фотометров и биохимических анализаторов

Содержание слайда: Корректирующие температурные коэффициенты для активности ферментов

Содержание слайда: Измерение по кинетике

Содержание слайда: Измерение по двум точкам При постоянной скорости кинетической реакции измерение можно проводить на любом отрезкелинейной кривой, приводя поглощение к 1 мин. Достоинства – простота, возможность измерения без стандарта, независимость в пределах линейного диапазона. Допустим при повторном использовании разовых кювет Следует убедиться что измерение проводится в линейном диапазоне

Содержание слайда: Измерение по двум точкам Возможны методические ошибки Если реакция начинается с очень высокой скоростью, то она может замедлиться или прекратиться из-за потребления всего субстрата. Несоответствие выяляется при сопоставлении клинических данных и биохимических исследований Реакция может иметь нелинейный характер

Содержание слайда: Измерение по двум точкам Реакция может задержаться на старте (Lag-фаза в мультиферментных системах) Обусловлена, по-видимому, задержкой образованием фермент-субстратного комплекса. Может продолжаться до нескольких минут Имеет значение порядок внесения реактивов – для лучшего перемешивания реактив большего объема добавлять к меньшему объему. В измерительную кювету вносится сначала проба, а затем рабочий реактив.

Содержание слайда: Многоточечное измерение Позволяет оценивать характер кинетики и выбирать для расчетов линейный участок Является наиболее точным методом определения активности ферментов Изменение оптического поглощения должно быть одинаковым за равные промежутки времени (отклонение от линейности не должно превышать 10%)

Содержание слайда: Многоточечное измерение Измерение по начальной скорости Скорость увеличивается в зависимости от количества фермента при одинаковой начальной концентрации субстрата Возникает в случае малого количества фермента Плато достигается, но время его достижения может быть большим. Регистрацию ведут на нелинейном участке

Содержание слайда: Измерение по начальной скорости Измерение скорости реакции. Регистрируется изменение в каждый момент времени светопропускания. Показатель, соответствующий максиальной скорости – значение максимальной скорости измененияоптического поглощения. Доступен только автоматическим анализаторам

Содержание слайда: Многоточечное измерение Кинетический метод с коррекцией по бланку образца Используется для определения активности ферментов и количественного измерения концентрации субстратов Одновременно может меняться бланк рабочего реактива

Содержание слайда: Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения реакции после добавления дополнительного количества антигена –малые дозы калибратора) При постановке на обычном фотометре необходимо знать диагноз. Избыток антигена наблюдается в чрезвычайной ситуации. При миеломной болезни концентрация IgG может быть очень высокой, и исследование попадает в зону избытка антигена. Необходимо электрофоретическое исследование В качестве стандартов и контрольных материалов необходимо использовать стандарты и сыворотки, содержащие индивидуальные белки, концентрация которых измерена с использованием иммунохимической реакции

Содержание слайда: Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов

Содержание слайда: Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Двухлучевое фотометрирование

Содержание слайда: Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Двухлучевое фотометрирование

Содержание слайда: Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Двухлучевое фотометрирование

Содержание слайда: Волоконный световод минимизирует оптическую схему

Содержание слайда:

Содержание слайда: Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Двухлучевое фотометрирование

Содержание слайда: Рассеяние света Мутный раствор в кювете - поглощает свет (если окрашен) - частично проходит, не изменяя направления (трансмиссия) - частично рассеивается, изменяя направление под различными углами (рассеивание)

Содержание слайда: Рассеяние света Трансмиссия и рассеивание зависят от - длины волны светового потока - частоты светового потока - интенсивности светового потока - свойств рассеивающей среды (размера и формы частиц, количества, способности к поляризации и др) Если в процессе измерения размер частиц в растворе меняется, будет меняться поток проходящего и рассеивающего света

Содержание слайда: Определение светорассеивания Зависит от длины волны (λ) Диаметра частиц, на которых происходит рассеивание Если размер частиц значительно меньше длины волны светового потока (<λ/10) – упругое рассеяние

Содержание слайда: Интенсивность потока, рассеиваемого небольшими частицами, подчиняется уравнению Релея

Содержание слайда: В основе рассеяния малых частиц лежит явление дифракции Рассеяние света каждой частицей не зависит друг от друга. Рассеянный свет распространяется во всех направлениях Максимальное количество света рассеивается под углом 0 и 180º При λ 400нм – такой тип рассеивания характерен для частиц диаметром < 40 нм (иммуноглобулины,β- липопротеины, альбумин)

Содержание слайда: При увеличении размеров частиц (40-400 нм)рассеивание становится несимметричным Максимальное количество света рассеивается в направлении падающего луча При λ 400нм (Ig M, хиломикроны, формирующиеся комплексы антигенов с иммуноглобулинами)

Содержание слайда: При превышении длины света (диаметр > 400 нм) несимметричность светорассеяния увеличивается Характерен для взвеси бактерий, клеток крови (тромбоциты, эритроциты)

Содержание слайда: Нефелометрия Измерение рассеянного света Сравнивая величины рассеянного и падающего света можно определять концентрацию вещества в растворе

Содержание слайда: Оптическая схема нефелометра

Содержание слайда: Турбидиметрия Измерение прошедшего света Турбидиметры построены по типу фотометров

Содержание слайда: Турбидиметрия Выражение, подобное закону Бугера-Ламберта для окрашенных растворов t – молярный коэффициент мутности раствора (турбидность) В качестве турбидиметров можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов Обычно используются короткие волны (340 нм), т.к. доля рассеянного света увеличивается обратно пропорционально четвертой степени длины волны – т.е. при меньшей длине волны прошедший свет будет составлять большую часть от падающего, для более короткого ультрафиолета нужна специальная оптика

Содержание слайда: Турбидиметрия и нефелометрия Используются для определения индивидуальных белков Особенность – построение калибровочного графика с использованием не менее пяти концентраций (калибровочный график имеет нелинейный характер)

Содержание слайда: Кривая доза-эффект При взаимодействии антиген-антитело образуют агрегаты

Содержание слайда: Кривая доза-эффект При пропорциональной концентрации антигенов и антител комплекс выпадает в осадок – преципитат. В супернатанте не определяются антитела и антигены – эквивалентное состояние

Содержание слайда: Кривая доза-эффект При увеличении концентрации антигенов количество антител недостаточно для полного связывания белка. Частицы иммунных комплексов становятся мелкими, преципитат не формируется. В супернатанте – свободные антигены – антиген-эксцесс

Содержание слайда: Кривая доза-эффект Классическая преципитационная кривая Хайдельберга-Кендаля

Содержание слайда: Калибровочный график Строится для -каждого индивидуального белка -каждого прибора -при любом условий регистрации -периодически при проведении исследований При серийных исследованиях в стандартных условиях допускается корректировка графика на основании измерения одного из стандартов. (вид стандартной кривой не меняется из-за влияния систематических факторов, происходит параллельный сдвиг всего графика)

Содержание слайда: Состав реакционной смеси подбирается так, чтобы измерение производилось в зоне избытка антител. При очень высокой концентрации белка антител недостаточно, частицы преципитата становятся мелкими (нисходящая часть кривой) – с увеличением концентрации белка сигнал прибора уменьшается. Может быть выдан неправильный результат. Проводят разведение биологической жидкости Если сигнал увеличивается – определение проводилось в нисходящей части кривой Разведение проводят до степени избытка антител

Содержание слайда: Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения реакции после добавления дополнительного количества антигена –малые дозы калибратора) При постановке на обычном фотометре необходимо знать диагноз. Избыток антигена наблюдается в чрезвычайной ситуации. При миеломной болезни концентрация IgG может быть очень высокой, и исследование попадает в зону избытка антигена. Необходимо электрофоретическое исследование В качестве стандартов и контрольных материалов необходимо использовать стандарты и сыворотки, содержащие индивидуальные белки, концентрация которых измерена с использованием иммунохимической реакции

Содержание слайда:

Содержание слайда: КЛИНИЧЕСКИЙ СПЕКТРОФОТОМЕТР

Содержание слайда:

Содержание слайда: Кормей-мульти – программируемый фотометр с проточной кюветой

Содержание слайда:

Содержание слайда: Спектр поглощения производных гемоглобина

Содержание слайда: