Содержание слайда: МЕТОД ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
МЕТОД ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Метод флуоресцентной спектроскопии является одним из наиболее распространенных для изучения физикохимических свойств биологических систем и, в частности, структуры белков. Этот метод позволяет следить за изменениями в микроокружении собственных флуорофоров белка или введенной флуоресцентной метки. Белки содержат три аминокислотных остатка, которые вносят основной вклад в собственную флуоресценцию белка (тирозин, фенилаланин и триптофан). Собственная флуоресценция большинства белков обусловлена, в первую очередь, триптофановыми остатками. Для селективного возбуждения остатков триптофана используется диапазон длин волн 295–305 нм, в котором поглощение тирозина и фенилаланина минимально. Флуоресцентные свойства триптофана крайне чувствительны к изменению его микроокружения, и главным образом, полярности. В соответствии с этим, комплексообразование с низкомолекулярными лигандами и макромолекулами, денатурация, агрегация и другие процессы существенным образом влияют на спектры флуоресценции белков. Например, при термоденатурации ХТ триптофановые остатки переходят из гидрофобных областей белка в полярное водное микроокружение. В результате этого мах собственной флуоресценции белка сдвигается в сторону больших длин волн (от 333 до 340 нм), а интенсивность флуоресценции увеличивается в два раза. Следует учесть, что триптофан в свободном состоянии) характеризуется в водном растворе мах 354 нм. Высокая чувствительность метода (10–6–10–7 М по белку) позволяет исследовать разбавленные растворы, что важно при изучении структуры склонных к агрегации белков, а также в случае, когда необходимо следить за структурой фермента в условиях определения его каталитической активности (обычно это концентрации белка 10–6–10–7 М). Однако детальный анализ собственной флуоресценции белков затрудняется как обилием факторов, влияющих на флуоресценцию триптофана, так и наличием в белках нескольких остатков триптофана, различающихся микроокружением и степенью экспонированности. Спектры испускания остатков перекрываются во всем используемом диапазоне длин волн, в связи с чем крайне сложно разделить спектральные вклады каждого из них Разделение вкладов триптофановых остатков в спектр флуоресценции белков Установить спектральные вклады различных триптофановых остатков можно путем изучения кинетики затухания флуоресценции методoм разрешенновременной флуоресцентной спектроскопии, позволяющим определить флуоресцентные времена жизни для каждого из триптофановых остатков , а также с помощью дифференциального метода анализа флуоресцентных спектров. Преимущество последнего метода состоит в существенно большем разрешении пиков по сравнению с интегральным спектром. Данный метод анализа спектров наиболее широко применяется в абсорбционной и ИК спектроскопии. На основе анализа пространственной структуры белка (из данных РСА) и данных по кинетике затухания флуоресценции (или динамического тушения флуоресценции) в спектре испускания осуществляют соотнесение флуоресцентных мах к индивидуальным триптофановым остаткам . Разделение спектра флуоресценции и идентификация индивидуальных триптофановых остатков основаны на предположении о влиянии микро& окружения флуорофора на зависимость времени затухания от длины волны. Идентификация индивидуальных триптофановых остатков в спектрах флуоресценции позволяет получить детальную информацию об изменении структуры белка.