Презентация Методы разделения белковых смесей. Хроматография онлайн

Содержание слайда: Методы разделения белковых смесей Хроматография Лекция 4

Содержание слайда: План лекции Методы разделения белковых смесей Основные принципы хроматографии ВЭЖХ Инструментальное обеспечение

Содержание слайда: Методы разделения белковых смесей Высокоэффективная жидкостная хроматография разделение по заряду, молекулярной массе, степени гидрофобности, специфическом взаимодействии с носителем Электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия разделение по величине молекулярных масс Изоэлектрофокусирование разделение по величине изоэлектрических точек Двумерный электрофорез изоэлектрическая точка+молекулярная масса Иммуноблоттинг (Вестерн-блоттинг) - визуализация детекция при помощи антител

Содержание слайда: Высокоэффективная жидкостная хроматография

Содержание слайда: Хроматография

Содержание слайда: История

Содержание слайда: Виды хроматографии

Содержание слайда: По способу введения пробы Элюентная хроматография (проявительная) Наиболее часто используемый вариант проведения аналитической хроматографии. Анализируемую смесь вводят в поток элюента в виде импульса . В колонке смесь разделяется на отдельные компоненты, между которыми находятся зоны подвижной фазы. Фронтальная хроматография Смесь непрерывно подают в колонку, при этом на выходе из колонки только первый, наименее удерживаемый компонент можно выделить в чистом виде. Остальные зоны содержат 2 и более компонентов. Родственный метод — твердофазная экстракция (сорбционное концентрирование). Вытеснительная хроматография В колонку после подачи разделяемой смеси вводят специальное вещество-вытеснитель, которое удерживается сильнее любого из компонентов смеси. Образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых веществ.

Содержание слайда: ТФЭ (SPE)

Содержание слайда: ТФЭ Назначение ТФЭ: очистка пробы от нежелательных примесей, концентирование компонентов пробы, перевод компонентов пробы на другую матрицу. Основные методы ТФЭ: одностадийная очистка, когда все нежелательные компоненты пробы собираются на сорбенте, а аналит собирается двухстадийная очистка и концентрирование, когда проба наносится на патрон вместе с нежелательнимы примесями, а потом с помощью более сильного элюента смывается аналит. Все нежелательные примеси остаются на сорбенте. трехстадийная очистка и концентрирование: на первом этапе все компоненты наносятся на патрон, на втором смываются легкие нежелательные компоненты, на третьем смывается аналит. Все тяжелые нежелательные примеси остаются на сорбенте.

Содержание слайда: По агрегатному состоянию фаз Газовая хроматография Газо-жидкостная хроматография Газо-твёрдофазная хроматография Жидкостная хроматография Жидкостно-жидкостная хроматография Жидкостно-твёрдофазная хроматография Жидкостно-гелевая хроматография Сверхкритическая флюидная хроматография

Содержание слайда: По механизму взаимодействия Распределительная хроматография Ионообменная хроматография Адсорбционная хроматография Эксклюзионная хроматография Аффинная хроматография Осадочная хроматография Адсорбционно-комплексообразовательная хроматография

Содержание слайда: Распределительная хроматография хроматографический метод, при котором неподвижная (стационарная) фаза химически связана с поверхностью неподвижного носителя. Подвижной фазой является жидкость (LLC — англ. liquid liquid chromatography), которая служит растворителем, или газ (газовая хроматография). Разделение происходит за счёт различия полярности разделяемых веществ. Частным случаем распределительной хроматографии является обращённо-фазная хроматография.

Содержание слайда: Ионобменная хроматография хроматографии позволяет разделять ионы и полярные молекулы, на основании зарядов разделяемых молекул. Данный вид хроматографии позволяет разделить практически любые заряженные молекулы, в том числе: крупные — белки, малые—молекулы нуклеотидов и аминокислот. Часто ионообменная хроматография используют как первый этап очистки белков. Принцип ионообменной хроматографии Ионообменная хроматография позволяет разделить молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа — катионную и анионную ионообменную хроматографию: Катионная ионообменная хроматография задерживает положительно заряженные катионы, так как неподвижная фаза имеет отрицательно заряженные функциональные группы, например, фосфат (PO43−). Анионная ионообменная хроматография задерживает отрицательно заряженные анионы, так как неподвижная фаза имеет положительно заряженные функциональные группы, например, +N(R)4.

Содержание слайда: Адсорбционная хроматография вид хроматографии, основанный на способности твёрдого вещества — неподвижной фазы — сорбировать примеси, находящиеся в подвижной фазе. Эффективность разделения примесей пропорциональна их величинам адсорбции при условиях эксперимента. Процесс взаимодействия может сопровождаться химическим взаимодействием примесей с неподвижной фазой, то есть хемосорбцией.

Содержание слайда: Эксклюзионная хроматографии (гель-фильтрация) молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. Первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. ! при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует.

Содержание слайда: Эксклюзионная хроматографии (гель-фильтрация) Объем образца лимитирующий для качества хроматографии Аналитическое разделение: не более 0,1% Vc Препаративное разделение: не более 8-10% Vc

Содержание слайда: Аффинная хроматография

Содержание слайда: По назначению аналитическая (динамический диапазон) препаративная (10 мг – 10 г) промышленная (тонны)

Содержание слайда: ВЭЖХ

Содержание слайда: ВЭЖХ Милихром

Содержание слайда: ВЭЖХ HP

Содержание слайда: ВЭЖХ Люмекс

Содержание слайда: ВЭЖХ Чешский прибор

Содержание слайда:

Содержание слайда:

Содержание слайда: Основные узлы хроматографа Дегазатор подвижной фазы Насос высокого давления + градиентный смеситель Система инжекции (автосэмплер) Колонка Детектор Коллектор фракций

Содержание слайда:

Содержание слайда: Подвижная фаза Обращеннофазовая хроматография метанол ацетонитрил вода ТГФ

Содержание слайда: Насос

Содержание слайда: Инжектор

Содержание слайда: Колонка

Содержание слайда:

Содержание слайда: Требования к сорбенту

Содержание слайда: Сорбенты

Содержание слайда: Виды детекторов ультрафиолетовый (УФ, UV) диодноматричный (PDA) рефрактометрический флуоресцентный кондуктометрический детектор радиоактивности масс-спектрометрический (МС, MS)

Содержание слайда: Детекторы

Содержание слайда:

Содержание слайда: Параметры

Содержание слайда: Параметры

Содержание слайда: Объем

Содержание слайда: Время

Содержание слайда: Эффективность

Содержание слайда: Параметры эффективности

Содержание слайда: Смысл

Содержание слайда: Селективность

Содержание слайда: Селективность

Содержание слайда: Параметры пиков

Содержание слайда: Эффективность и селективность

Содержание слайда: Заключение ВЭЖХ – мощный метод анализа сложных смесей Наиболее часто используется обращенно-фазовая ВЭЖХ Хроматограф включает следующие узлы Дегазатор подвижной фазы Градиентный смеситель Насос Инжектор Колонка Детектор Коллектор фракций