Презентация Молекулярно – генетические методы изучения генетики человека онлайн

Содержание слайда: МЗ РФ ВГМУ 2 высшее образование «Молекулярно – генетические методы изучения генетики человека Проф Каредина В.С.

Содержание слайда: Методы изучения генетики человека Клинико – генеалогический Близнецовый Популяционно – статистический Цитогенетический Метод генетики соматических клеток Биохимический метод Молекулярно – генетические Метод приемных детей Антропометрический Дерматоглифика

Содержание слайда: Молекулярно – генетические методы. Молекулярно – генетические методы. Конечный итог молекулярно-генетических методов — выявление изменений в определенных участках ДНК, гена или хромосомы. В их основе лежат современные методики работы с ДНК или РНК. В 70-80 гг. в связи с прогрессом в молекулярной генетике и успехами в изучении генома человека молекулярно-генетический подход нашел широкое применение. .

Содержание слайда: Начальным этапом молекулярно-гене-тического анализа является получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фрагменты. В последнем случае, чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их. Начальным этапом молекулярно-гене-тического анализа является получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фрагменты. В последнем случае, чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их. Для этого пользуются полимеразной цепной реакцией — быстрым методом ферментативной репликации определенного фрагмента ДНК. С его помощью можно амплифицировать любой участок ДНК, расположенный между двумя известными последовательностями.

Содержание слайда: Анализировать огромные молекулы ДНК в том виде, в котором они существуют в клетке, невозможно. Поэтому прежде их необходимо разделить на части, обработать разнообразными рестриктазами — бактериальными эндонуклеазами. Эти ферменты способны разрезать двойную спираль ДНК, причем места разрыва строго специфичны для данного образца. Расщепление ДНК рестриктазами дает характерный набор фрагментов (4-6 пар оснований), отличающихся по длине. Анализировать огромные молекулы ДНК в том виде, в котором они существуют в клетке, невозможно. Поэтому прежде их необходимо разделить на части, обработать разнообразными рестриктазами — бактериальными эндонуклеазами. Эти ферменты способны разрезать двойную спираль ДНК, причем места разрыва строго специфичны для данного образца. Расщепление ДНК рестриктазами дает характерный набор фрагментов (4-6 пар оснований), отличающихся по длине.

Содержание слайда: Фракционирование (т.е. разделение) фрагментов ДНК по размеру и длине проводится с помощью электрофореза на поверхности агарозного или полиакриламид-ного геля. Под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. (Чем короче фрагменты, тем быстрее они движутся). В результате каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Фракционирование (т.е. разделение) фрагментов ДНК по размеру и длине проводится с помощью электрофореза на поверхности агарозного или полиакриламид-ного геля. Под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. (Чем короче фрагменты, тем быстрее они движутся). В результате каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля.

Содержание слайда: Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения расстояния, пройденного им и стандартным (с известными размера­ми) отрезком ДНК. Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения расстояния, пройденного им и стандартным (с известными размера­ми) отрезком ДНК. Молекулярно -.генетическую диа­гностику наследственных болезней ис­пользуют и для изучения генома чело­века. Чтобы выявить необходимые для этого специфические фрагменты ДНК, используют блот-гибридизацию по Саузерну. Сущность этой методики кратко состоит в следующем: сначала осуществляют денатурацию ДНК с об­разованием одноцепочечных фрагмен­тов, которые переносят на нитроцеллюлезный или нейлоновый фильтр в буферном растворе.

Содержание слайда: Молекулярно - генетическую диагностику наследственных болезней используют и для изучения генома человека. Чтобы выявить необходимые для этого специфические фрагменты ДНК, используют блот-гибридизацию по Саузерну. Молекулярно - генетическую диагностику наследственных болезней используют и для изучения генома человека. Чтобы выявить необходимые для этого специфические фрагменты ДНК, используют блот-гибридизацию по Саузерну. Сущность этой методики кратко состоит в следующем: сначала осуществляют денатурацию ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов, которые переносят на нитроцеллюлезный или нейлоновый фильтр в буферном растворе.

Содержание слайда: Агарозный гель с фрагментами ДНК помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрирован­ным солевым раствором. На гель накладывают нитроцеллюлезный фильтр, а сверху помещают сухую фильтровальную бумагу, в которую впитывается солевой раствор. ДНК переносится вместе с раствором, но задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. Затем одноцепочечные ДНК фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле. Агарозный гель с фрагментами ДНК помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрирован­ным солевым раствором. На гель накладывают нитроцеллюлезный фильтр, а сверху помещают сухую фильтровальную бумагу, в которую впитывается солевой раствор. ДНК переносится вместе с раствором, но задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. Затем одноцепочечные ДНК фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле.

Содержание слайда: Чтобы выявить нужные фрагменты, проводят гибридизацию ДНК с радиактивным ДНК-зондом или клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геном­ной ДНК. Чтобы выявить нужные фрагменты, проводят гибридизацию ДНК с радиактивным ДНК-зондом или клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геном­ной ДНК. Результат гибридизации комплементарных цепей радиоактивного ДНК-зонда и фрагмента ДНК обнаруживают с помощью радиоавтографии: каждая комплементарная зонду последовательность ДНК проявляется в виде радиоактивной полосы.

Содержание слайда: С помощью метода Саузерна можно составить рестрикционную карту генома в участке исследуемого гена и установить, несет ли данный ген какие-либо дефекты. Так, разработаны эффек­тивные методы синтеза искусственных ДНК-зондов, которые используются в пренатальнои диагностике наследст­венных заболеваний. Для этого из эмб­риональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости плода, выделяют ДНК и гибридизируют ее с помо­щью Саузерн-блоттинга с радиоактивным ДНК-зондом. С помощью метода Саузерна можно составить рестрикционную карту генома в участке исследуемого гена и установить, несет ли данный ген какие-либо дефекты. Так, разработаны эффек­тивные методы синтеза искусственных ДНК-зондов, которые используются в пренатальнои диагностике наследст­венных заболеваний. Для этого из эмб­риональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости плода, выделяют ДНК и гибридизируют ее с помо­щью Саузерн-блоттинга с радиоактивным ДНК-зондом.

Содержание слайда: Аномальный эмбрион легко распознается, т.к. его ДНК будет гибридизоваться только с ДНК-зондом, комплементарным мутантной последовательности. Аномальный эмбрион легко распознается, т.к. его ДНК будет гибридизоваться только с ДНК-зондом, комплементарным мутантной последовательности. В настоящее время имеются различ­ные методы выявления мутаций. Их делят на прямые и косвенные. Прямая диагностика мутаций включает ряд методов: 1. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование), дающее возможность выявить замены оснований, делеции и вставки в изучаемом фрагменте.

Содержание слайда: 2. Выявление нарушения места рестрикции, с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Около 50% нуклеотидных замен ведет к изменению сайта (места) рестрикции. Это делает возможным выявить мутацию путем рестриктного анализа. 2. Выявление нарушения места рестрикции, с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Около 50% нуклеотидных замен ведет к изменению сайта (места) рестрикции. Это делает возможным выявить мутацию путем рестриктного анализа. Проведение аллелоспецифической гибриди-зации с синтетическими зондами, что позволяет обнаружить мутации в геномной ДНК. Последовательность оснований в зонде может быть задана по дефектному или нормальному варианту гена. В обоих случаях зонд используется для гибридизации с фрагментами ДНК обследуемого индивида.

Содержание слайда: Химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах неправильной сшивки оснований выявляет большую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК. Метод заключается в электрофорезе двух цепочечной ДНК в нейтральном или равномерно денатурирующем геле. Химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах неправильной сшивки оснований выявляет большую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК. Метод заключается в электрофорезе двух цепочечной ДНК в нейтральном или равномерно денатурирующем геле. Регистрация изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК.

Содержание слайда: Трансляция белкового продукта осуществляется в системе in vitrо на основе получения специфической мРНК с добавлением лизата ретикулоцитов. Синтезируемый белок анализируют с помощью электрофореза. Изменение подвижности белка указывает на наличие мутации. Трансляция белкового продукта осуществляется в системе in vitrо на основе получения специфической мРНК с добавлением лизата ретикулоцитов. Синтезируемый белок анализируют с помощью электрофореза. Изменение подвижности белка указывает на наличие мутации.

Содержание слайда: К косвенному выявлению мутаций прибегают в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще не расшифрована, но известно его положение на генетической карте. Технические приемы такие же, как и в прямой диагностике, но добавляется математический анализ. К косвенному выявлению мутаций прибегают в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще не расшифрована, но известно его положение на генетической карте. Технические приемы такие же, как и в прямой диагностике, но добавляется математический анализ. Диагностике мутаций способствует нахождение в геноме полиморфных по длине рестрикционных фрагментов. Их можно выявить с помощью блот-гибридизации по Саузерну.

Содержание слайда: Другим типам полиморфизма ДНК являются микросателлиты. Это корот­кие моно-, ди-, три- и тетрануклеотидные тандемно повторяющиеся последовательности ДНК. Они используются в качестве маркерных локусов аллельных вариантов гена или маркеров дефектных мутаций.. Другим типам полиморфизма ДНК являются микросателлиты. Это корот­кие моно-, ди-, три- и тетрануклеотидные тандемно повторяющиеся последовательности ДНК. Они используются в качестве маркерных локусов аллельных вариантов гена или маркеров дефектных мутаций..

Содержание слайда: В 1993 г. был идентифицирован ген, ответственный за возникновение тяжелого заболевания нервной системы у человека — хореи Гентингтона (ХГ). Болезнь, проявляющаяся после 40 лет, выражается в расстройстве движений, снижении интеллекта, в нарушении эмоционально-волевой сферы и др. Этот недуг наследуется по аутосомно-доминантному типу со 100 % пенетрантностью. Ген локализован в коротком плече 4-й хромосомы. В 1993 г. был идентифицирован ген, ответственный за возникновение тяжелого заболевания нервной системы у человека — хореи Гентингтона (ХГ). Болезнь, проявляющаяся после 40 лет, выражается в расстройстве движений, снижении интеллекта, в нарушении эмоционально-волевой сферы и др. Этот недуг наследуется по аутосомно-доминантному типу со 100 % пенетрантностью. Ген локализован в коротком плече 4-й хромосомы.

Содержание слайда: Оказалось, что ген ХГ содержит область, в которой нуклеотидная последовательность представлена многократным повторением трех нуклеотидов — ЦАГ (цитозин-аденин-гуанин) геномной ДНК. В норме количество таких повторов колеблется от 11 до 34, а у больных ХГ их 37-86 (в среднем 45). И, следовательно, хорея Гентингтона относится к наследственным заболеваниям, при котором мутация гена состоит в экспансии (многократном увеличении числа копий) тринуклеотидных ЦАГ-повторов. Оказалось, что ген ХГ содержит область, в которой нуклеотидная последовательность представлена многократным повторением трех нуклеотидов — ЦАГ (цитозин-аденин-гуанин) геномной ДНК. В норме количество таких повторов колеблется от 11 до 34, а у больных ХГ их 37-86 (в среднем 45). И, следовательно, хорея Гентингтона относится к наследственным заболеваниям, при котором мутация гена состоит в экспансии (многократном увеличении числа копий) тринуклеотидных ЦАГ-повторов.

Содержание слайда: Установлено, что форма болезни более тяжелая, если ХГ проявляется в молодом возрасте, наследуется по отцовской линии и нарастает в последующих поколениях. Ученые пришли к выводу, что число ЦАГ- повторов тесно связано и со сроком появления первых симптомов, и с тяжестью заболевания. В 1992 г. экспансия тринуклеотидных ЦТГ- повторов была обнаружена в гене, который вызывает миотоническую дистрофию. Этот ген, названный ДМ-1, был картирован на 19-й хромосоме. Установлено, что форма болезни более тяжелая, если ХГ проявляется в молодом возрасте, наследуется по отцовской линии и нарастает в последующих поколениях. Ученые пришли к выводу, что число ЦАГ- повторов тесно связано и со сроком появления первых симптомов, и с тяжестью заболевания. В 1992 г. экспансия тринуклеотидных ЦТГ- повторов была обнаружена в гене, который вызывает миотоническую дистрофию. Этот ген, названный ДМ-1, был картирован на 19-й хромосоме.

Содержание слайда: Длина последовательности ЦТГ- повторов весьма различна. Если в нормальной популяции она колеблется от 5 до 30, то у больных миотонической дистрофией, количество повторов может достигать многих сотен. Длина последовательности ЦТГ- повторов весьма различна. Если в нормальной популяции она колеблется от 5 до 30, то у больных миотонической дистрофией, количество повторов может достигать многих сотен. Болезнь наследуется по аутосомно-доминантному типу, обычно начинается в зрелом возрасте и проявляется прогрессирующей мышечной слабостью, а в некоторых случаях задержкой умственного развития, поражением скелета, сердечнососудистой системы и глаз.

Содержание слайда: Для миотонической дистрофии характерно возрастание тяжести болез­ни на протяжении трех или четырех по­колений. Если в первом поколении болезнь возникает в зрелом возрасте и проявляется лишь развитием катарак­ты или легким нарушением сократимости мышц, то в последующих поколениях болезнь начинается сразу после рождения ребенка, у которого развива­ется выраженная мышечная слабость, задержка умственного развития. Для миотонической дистрофии характерно возрастание тяжести болез­ни на протяжении трех или четырех по­колений. Если в первом поколении болезнь возникает в зрелом возрасте и проявляется лишь развитием катарак­ты или легким нарушением сократимости мышц, то в последующих поколениях болезнь начинается сразу после рождения ребенка, у которого развива­ется выраженная мышечная слабость, задержка умственного развития.

Содержание слайда: В последние годы было показано, что подобный механизм мутаций характерен и для ряда других наследственных заболеваний нервной системы человека: болезни Кеннеди, синдрома фрагильной (ломкой) Х-хромосомы и др. В последние годы было показано, что подобный механизм мутаций характерен и для ряда других наследственных заболеваний нервной системы человека: болезни Кеннеди, синдрома фрагильной (ломкой) Х-хромосомы и др.